Die Chirurgische Forschung ist eine integrierte Sektion der Chirurgischen Klinik des Bergmannsheils. Fragestellungen für die Klinik werden hier in einem interdisziplinären Team von Expertinnen und Experten aus den Bereichen Medizin, Biologie, Physik und Chemie bearbeitet. Das Forschungsspektrum reicht von der angewandten Materialwissenschaft zur Entwicklung und Testung neuer Biomaterialien über neue Möglichkeiten der Nanotechnologie zum Beispiel zur Bekämpfung bakterieller Infektionen bis hin zum Einsatz von körpereigenen Stammzellen für die Therapie schlecht heilender Frakturen. Die Forschenden nutzen ein breites Methodenspektrum von der Zellbiologie bis zur Elektronenmikroskopie für verschiedene aktuelle Projekte von der Stammzellforschung bis zur Neurotraumatologie.
Schwerpunkte
An Biomaterialien müssen besonders hohe Maßstäbe bezüglich Funktion, Sicherheit und der jeweiligen Gewebeverträglichkeit (Biokompatibilität) gestellt werden. Die zunehmende Anzahl unterschiedlicher Implantatmaterialien in der Klinik bei stetigen Neu- und Weiterentwicklungen von Biomaterialien erfordert eine schnelle und besonders auch präklinische Testung im Labor hinsichtlich Biokompatibilität und den neuen Möglichkeiten einer Biofunktionalisierung. Bei dem letzteren Aspekt will man das Biomaterial so gestalten, dass z.B. durch eine besondere Oberflächentopologie - sei es als Makro, Mikro- oder sogar als Nanostruktur oder durch Beschichtungen - eine aktive Interaktion mit dem umgebenden Gewebe im Sinne einer besseren Gewebsintegration erzielt wird. Hier sind also biochemische und biologische Wechselwirkungen mit dem Empfängergewebe gewollt und erwünscht. Ein weiterer Faktor bei der Entwicklung von Implantatmaterialien ist der Wunsch, die Anheftung von pathogenen Mikroorganismen zu minimieren oder sogar zu verhindern. Kann man das Infektrisiko durch Einsatz neuer Metall-Biomaterialien beeinflussen? Diese Frage ist auf dem Hintergrund zunehmender mikrobieller Antibiotika-Resistenzen und stetig steigender Prothesenzahl ein hochaktuelles Thema in der Chirurgie.
„Trabecular Metal“ (Zimmer GmbH), ursprünglich für die Weltraumtechnik entwickelt, ist ein neuer Werkstoff für den Knochen- und Gelenkersatz. Genau besehen ist es ein Bälkchennetzwerk – überraschend ähnlich der Struktur des schwammartigen, aus Bälkchen (lat. Trabekel) strukturierten Knochenanteils (sog. Spongiosa). Seine Druckfestigkeit und Elastizität liegt zwischen derjenigen des spongiösen Knochens im Knocheninneren und der harten äußeren Knochenkortikalis. Damit ist es ein stabiler „Leichtbauwerkstoff“ für Implantate, mit dem weiteren Vorteil, dass die Poren des Materials ähnlich groß wie bei Knochen sind und damit das Einwachsen von Blutgefäßen ermöglichen. Das Biomaterial besteht zu 98% aus dem Metall Tantal. Tantal (von Tantalos, einer Figur der griechischen Mythologie) ist extrem hitzefest und sogar noch korrosionsbeständiger als Titan.
Mikrobiologische Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben nachgewiesen, dass die Anheftung von klinischen Problemkeimen wie Staphyloccocus aureus an dieses Material im Vergleich zu herkömmlichen Implantatmetallen wie z. B. Titan reduziert ist. Weitere Untersuchungen zeigten auch, dass durch die besondere Mikro- und Nanostruktur der Tantaloberfläche Abwehrzellen des Blutes zu einer verstärkten anti-mikrobiellen Leistung aktiviert werden. Einerseits können sich Leukozyten gut an die Oberflächenstruktur anlagern und andererseits werden die adhärenten Leukozyten aktiviert und setzen sog. Mediatoren frei, die auch in der Mikroumgebung (z. B. in bakteriell kontaminiertem Blut) zu einer erhöhten Abtötung dieser Keime im Blut führen.
Alle Metalle bestehen in ihrer kleinsten also atomaren Struktur aus sogenannten Kristallgittern, in denen die Atome zu einer ganz bestimmten Struktur angeordnet sind. Wird ein Metall verformt, so geht diese atomare Anordnung verloren. Das Metall ist bleibend verformt (plastisch deformiert). Formgedächtnismetall oder auch Memory-Metall (memory = engl. für Gedächtnis, Erinnerung) verhält sich anders. Wird ein Memory-Metall verformt, so verändert sich zwar die Kristallgitterstruktur, wird aber nicht zerstört. Wird nun dieses verformte Metall auf eine bestimmte Temperatur erwärmt (z.B. Körpertemperatur), so nehmen die Atome im Kristallgitter wieder ihre ursprüngliche Anordnung ein und die ursprüngliche Form kehrt ohne weitere äußere Kraftanwendung wieder zurück. Das Metall “erinnert sich“ genau an die Form, die es vorher hatte. Diese ganz ungewöhnliche Eigenschaft der Memory-Metalle hat bereits teilweise Eingang in die Klinik gefunden z.B. als Implantat-Verankerungen, die sich unter Körpertemperatur vergrößern und so für mehr Passfestigkeit sorgen oder als selbst öffnende Metallnetze zur Erweiterung verengter Blutgefässe.
Aber die vielversprechenden Möglichkeiten der Memory-Metalle haben im klinischen Einsatz einen Nachteil: Memory-Metalle bestehen i.a. aus gleichen Anteilen von Nickel und Titan. Während Titan eine relativ gute Gewebsverträglichkeit hat - man spricht von guter Biokompatibilität - ist Nickel dagegen kritisch zu sehen. Im Labor der Chirurgischen Forschung werden Untersuchungen zur Materialverträglichkeit durchgeführt. Die Biokompatibilität von Memory-Metall-Legierungen, der jeweiligen Beschichtungen und Oberflächen-Struktur wird zellbiologisch erfasst. Hier wird durch Einsatz von isolierten menschlichen Blutzellen, knochenbildenden Zellen oder auch Stammzellen die Wechselwirkung dieser Zellen mit den Implantat-Materialien studiert. Untersucht wird z.B., ob Zellen an das Material gut anhaften können, ob sie sich auf dem Material vermehren können oder aber Zellschädigungen auftreten. Derartige Untersuchungen sind Voraussetzung für jede Neuentwicklung von Implantat-Materialien.
Sie gilt als eine Schlüsseltechnologien des 21. Jahrhunderts: die Nanotechnologie. Mit der Entwicklung von neuen Nano-Werkstoffen und Nano-Materialien werden heute große Hoffnungen verbunden. Der Grund, warum sich die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler aus der Chirurgischen Forschung im Bergmannsheil mit nanopartikulärem Silber beschäftigen, ist nahe liegend: Die antimikrobielle Wirkung von Silber ist zwar schon sehr lange bekannt, der Siegeszug der Antibiotika hat die Anwendung von Silber im medizinischen Bereich aber fast vergessen lassen. Inzwischen haben viele Mikroorganismen, die als Problemkeime in Krankenhäuern zu finden sind, Resistenzen gegen Antibiotika entwickelt. Diese Keime können lebensbedrohliche Infektionen hervorrufen. Daher sucht die Medizin mit Nachdruck nach Alternativen für einen Antibiotika-Einsatz oder Möglichkeiten, die Ausbreitung dieser Mikroorganismen einzudämmen. Hier bietet nanopartikuläres Silber eine neue Perspektive: Metallisches Nanosilber in Beschichtungen auf Kathetern, OP-Geräten, Sterilverpackungen oder auch Prothesen sind nur einige Beispiele. Die Vorteile der Nanopartikel sind durch ihre Winzigkeit gegeben: die kleinen Partikel besitzen im Vergleich zu großen Körpern eine riesige Oberfläche, von der kontinuierlich Silber freigesetzt wird und so das Wachstum der Mikroorganismen gehemmt werden kann.
Die Nanotechnologie bietet faszinierende neue Anwendungsmöglichkeiten und das Ziel unserer Arbeitsgruppe ist es, die Reaktion von Nanopartikeln mit körpereigenen Zellen in ihren Grundlagen zu verstehen. Technologische Entwicklungen können sich bei Erfolg schnell am Markt durchsetzen. Wir wollen nicht nur mögliche Risiken erkennen, wir wollen auch durch ein besseres Verstehen neue und sichere Anwendungen für die Klinik finden.
Im Mittelpunkt der translationalen Stammzellforschung steht die Entwicklung und Testung innovativer Strategien für die Zelltherapie von kritischen Frakturen oder großen Knochendefekten. Unsere Untersuchungen konzentrieren sich dabei auf die Evaluierung kompatibler Trägermaterialien für Stammzellen aus resorbierbaren oder nicht-resorbierbaren Biomaterialen. Neben zell- und molekularbiologischen Fragestellungen zur Toxizität und Kompatibiltät der Materialen, zur Zellbesiedlung und –proliferation, zielt die Forschung auch auf konkrete Fragestellungen, die sich aus einer klinischen Anwendung von Stammzellen ergeben. Ein wesentlicher Aspekt dabei ist es, möglichst autologe (patientinnen- und patienteneigene) Stammzellanreicherungen für die regenerative Medizin einzusetzen. Damit werden spätere Immunreaktionen gegen die transplantierten Zellen vermieden.
Fragestellungen nach einem idealen Trägermaterial der Stammzellen z.B. für die Zelltherapie bei kritischen Frakturen haben gerade unter dem Gesichtspunkt, ein rein autologes Material zu verwenden, große Bedeutung: Zur Fixierung von expandierten Stammzellen kann man autologes Blutplasma verwenden und so eine gelee-artige aber feste Matrix herstellen, die vom Chirurgen einfach zu handhaben ist. Hier werden Untersuchungen durchgeführt, die eine optimale Zusammensetzung der Matrix zum Ziel haben. Zusätzlich werden Forschungen zur osteogenen Differenzierung von Stammzellen vorangetrieben, wobei die osteogen-wirkenden Faktoren ebenfalls rein aus autologen Patientinnen- und Patientenzellen gewonnen werden können. Eine potentielle Gefährdung der Patientin / des Patienten durch mögliche Transfektion beim Einsatz von Spendermaterial oder durch ungewünschte Reaktionen beim Einsatz von rekombinant-hergestellten Differenzierungs- oder Wachstums-faktoren soll damit ganz ausgeschlossen werden.
Optimierung einer dreidimensionalen Fibrinmatrix (Plasmaclot) als Trägermaterial für humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) zur Knochenregeneration: Die Zelltherapie von kritischen Frakturen oder großen Knochendefekten unter Verwendung von adulten mes-enchymalen Stammzellen ist ein viel versprechender Therapieansatz. Der wesentliche Vorteil gezüchteter Stammzelltransplantate besteht darin, dass durch die mögliche Kultivierung der Zellen ein autologes Transplantat mit hoher Zellzahl zur Verfügung steht. Der Nachteil konventioneller autologer Knochentransplantate (z.B. Spongiosaplastik) ist eine limitierte Verfügbarkeit und die entstehende Komorbidität. Die Machbarkeit eines klinischen Einsatzes von expandierten autologen Knochenmarkzellen für nicht heilende Frakturen konnte in der eigenen Klinik bereits gezeigt werden. Die Viabilität der Zelltransplantate innerhalb der dabei verwandten Trägermatrix (autologer Plasmaclot) ist jedoch noch nicht optimal. Die Verwendung derartiger autologer Plasmaclots als Trägermaterial ist dagegen ideal, weil ausschließlich autologes Gewebe eingesetzt werden kann und allogene oder xenogene Zusätze wie bei kommerziellen Fibrinmatrices nicht nötig sind. Ziele dieses Projektes sind, die Entwicklung einer Plasmagel-Matrix, die nach Plasmakoagulation eine genügend aus-reichende manuelle Handhabung aufweist und gleichzeitig eine möglichst hohe Viabilität der Zellen und eine osteogene Differenzierung ohne exogene Differenzierungsfaktoren ermöglicht.
Untersuchung der simultanen Elektroverspinning autologer, humaner mesenchymaler Stammzellen und biometrischer Materialien zum in vitro Aufbau gerichteter Zell-Biomaterial-Hybride für die Knochenregeneration: Mit Hilfe des Elektroverspinnens (Elektrospinnings), einem Verfahren zum Ausspinnen nanoskaliger Endlosfasern, sog. Nanofilamente, aus wässrigen, pysiologisch gepufferten Lösungen, können Trägerstrukturen in der Dimension von fasrigen Bestandteilen der Extrazellulären Matrix (ECM) aufgebaut werden. Im Zusammenhang mit dem Aufbau von Knochenzell-Matrix-Hybriden bietet diese Technologie die Möglichkeit, Knochenzellen bzw. -stammzellen und Biomaterialien gemeinsam auszuspinnen. Ein entscheidender Vorteil dieser Vorgehensweise besteht in der homogenen Besiedelung der Trägerin / des Trägers mit Zellen zum Zeitpunkt der Trägerfertigung unter weitestgehend physiologischen Bedingungen.
Hohe systemische Konzentrationen einer Vielzahl von inflammatorischen und anti-inflammatorischen Mediator-molekülen sind ein zentrales pathophysiologisches Merkmal der trauma-induzierten Immundysregulation. Etablierte zelluläre Modelle für ein derartiges Mediatormuster stehen zur Verfügung. Ein Standardmodell ist die Stimulation von isolierten pheripheren Leukozyten mit bakteriellen Toxinen (Lipopolysaccharid, Toxic shock syndrome-Toxin-1).
Unsere Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass LPS-stimulierte Leukozyten einen Faktor bzw. Faktoren freisetzen, die eine osteogene Zelldifferenzierung von mesenchymalen Stamm-zellen induzieren. Im Rahmen des Projektes soll die osteogen-wirkende Aktivität durch Separation/Isolierung und immunologische Methoden charakterisiert werden und die potentielle Rolle von Toll-Like-Rezeptoren auf MSC für eine osteogene Differenzierung untersucht werden.
Die Kombination von Leitlinienstrukturen mit autologen wachstumsfördernden biochemischen Signalen ist bei der posttraumatischen Nervenregeneration ideal. Eine autologe Plasmamatrix könnte diese Kriterien erfüllen, wenn es möglich ist, Fibrinfasern beim Clotting-Prozess auszurichten. Durch die gute Biokompatibilität und den schrittweise Abbau besitzt eine autologe Fibrinmatrix durch die Bindung von autologen Wachstumsfaktoren Vorteile gegenüber chemischen Polymermatrices. Durch die Etablierung längs ausgerichteter Fibrinfasern und seiner autologen Natur kann diese Plasma-Matrix für gerichtetes Nervenwachstum sehr geeignet werden.
Ziel dieser Forschung ist es deswegen auf der Basis eines autologen Plasmaclots eine längsgerichtete Fibrin-Matrix zu entwickeln, um regenerierende Nervenzellen gerichtet durch stabilitätsgebende Leitschienen zu führen. Zusätzlich sollen Überstände von autologen Stammzellen hinsichtlich der Regeneration von Nervenzellen untersucht werden.
Interleukin-17 (IL-17), ein biologisch hoch potentes Cytokin, wird von einer neu identifizierten T-Zell-Subpopulation (Th17/ThIL-17) produziert. IL-17 als zentraler Mediator in inflammatorischen Prozessen verbindet die T-Zell-Stimulation mit der Mobilisierung von Neutrophilen. Die Rolle von IL-17 in der Immundysfunktion nach einem Polytrauma ist allerdings noch nicht geklärt. In der Chirurgischen Forschung werden Plasmaproben von Polytraumapatienten hinsichtlich systemischer IL-17-Konzentrationen analysiert. Zusätzlich werden PBMCs der entsprechenden Patientinnen und Patienten mit Hilfe der FACS- und ELISpot-Technik auf der Basis von Einzelzellanalysen nach ihrem Gehalt an Th17/ThIL-17 Zellen untersucht.
Die Forschungsschwerpunkte unseres biomechanischen Labors umfassen Fragestellungen aus der anwendungsorientierten Forschung wie Prüfung und Optimierung von innovativen Osteosynthesesystemen oder Entwicklung neuer verbesserter Methoden für die osteosynthetische bzw. prothetische Behandlung von Frakturen.
Laborausstattung und Methoden
- Zellkulturtechniken (primäre Zellen und Zelllinien, einschließlich mesenchymale Stammzellen), Lagerung in Flüssig-Stickstoff
- Stammzellisolierung aus Aspirat und Leukozytenisolierung aus Vollblut (Ficoll-Gradientenmethode)
- Zellviabilitätstests und Zellproliferation (Calcein-AM-Propidiumiodid, Alamar Blue), Auswertung mittels digitaler Phasenanalyse
- Stammzell-Differenzierungsassays (osteogen, adipogen, chondrogen, neuronal)
- Chemotaxis-Assays (FluoroBlock-Transwell, FACS)
- Bildung reaktiver Sauerstoff-Metabolite (FACS)
- Phagozytose-Assay und Makropinocytose-Assay (FACS)
- Zellepitop-Analysen (FACS, Immunohistochemie)
- Freisetzung von Cytokinen und Wachstumsfaktoren (ELISA, semiquantitativer Dot-Array)
- Zellorganell-Markierung (Fluoreszenzmikroskopie)
- Apoptose-Assays (Annexin V und TUNEL)
- Quantitativer Nachweis von Substanzen (z.B. Antibiotika) im Gewebe (HPLC)
- Rasterelektronenmikroskopie (REM) mit Sputteranlage und Kritische-Punkt Trocknung von Feucht-Proben
- Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM)
- Konzentrieren von Flüssigproben über Lyophilisation
- Mikrobiologische Methoden (Keime der Sicherheitsstufe 2) MHK, MBK, Baclight
- Elektrospinning von Polymer-Biomaterialien
- Biomechanische Testungen
- Laminar-Air-Sicherheitswerkbänke ( Thermo Hera Safe 15 bis 18)
- Zellkultur-Brutschränke (Heraeus Function Line)
- Inverse Mikroskope mit angeschlossener digitaler Bildgebung (Olympus CK2, Peqlab EVOS core )
- Kühl-Tischzentrifugen (Hettich Universal 320 R, Beckmann CS-6R, Thermo Megafuge 1.OR)
- Tisch-Minizentrifugen (Eppendorf Biofuge)
- BD FACSCalibur Durchflusscytometer (zwei Laser-Ausstattung)
- Elektronenmikroskop Zeiss DSM 962 mit Umlaufkühlung
- Proben-Sputteranlage (EMITECH K500)
- Kritische-Punkt-Trocknung (EMITECH K850)
- Gefrier-Trocknungsanlage (Lyovac GT2)
- Elektrospinn-Anlage
- UV/VIS-Spektrophotometer (Shimadzu UV mini 1240)
- Fluoreszenzmikroskop BX61 (Olympus) mit CellP-Software (Olympus) und Schrittmotor für automatische Stack-Aufnahmen
- Fluoreszenzmikroskop MVX 10 (Olympus)
- Digitale Mikroskopkameras (Colorview, F-View)
- Konfokales Laser Scanning Mikroskop (Zeiss LSM700 inverser Aufbau ) mit AxioCam MRm
- HochleistungsflüssigkeitsChromatographie (HPLC)
- Waters 2690 Alliance Anlage
- Dual Absorbance Detektor (Waters 2487)
- Multi-Lambda Fluoreszendetektor (Waters 2475).
- Chromatographieauswerteprogramm Empower 3 (Waters)
- Fluoreszenz-Multiplatten-Lesegerät FLUOstar OPTIMA (BMG-Labtech)
- Multiplatten-Lesegerät MRX Revelation (Dynex)
- Plate-Washer MRV (Dynex) programmierbar
- Biomechanik-Prüfmaschine